1901年9月，蔡元培受聘為南洋公學特科班總教習。南洋公學為中國近代歷史上最早創辦的大學之一，於光緒廿二年由盛宣懷創建於上海，是今天上海交通大學的前身。清末民初，稱江蘇、浙江、福建、廣東等沿海各省為「南洋」，與江蘇以北的「北洋」並稱。而蔡元培於南洋公學任教時便投身入推翻滿清政權的革命洪流之中。蔡元培回憶說：「36歲以後，我已決意參加革命工入作。」1904年，即光緒30年，蔡元培在上海建立了光復會，獲推舉為會長。光復會又名復古會，是辛亥革命時期中國三大組織之一。光復會入會誓詞是「光復漢族，還我河山，以身許國，功成身退」。而光復會的宗旨是「以暴動和暗殺」為手段推翻滿清統治。著名成員包括：徐錫麟、秋瑾、陶成章等。1905年，同盟會成立，光復會併入，蔡元培成為同盟會上海分會負責人。